Producción

Académica

Galván, Cristian Ariel

Relevancia de los rafts en la

polaridad neuronal e

implicancias de sus

alteraciones en la enfermedad

de Niemann-Pick tipo A

Tesis para la obtención del título de posgrado de

Doctor en Bioquímica

Director: Ledesma Muñoz, María Dolores

Documento disponible para su consulta y descarga en Biblioteca Digital - Producción Académica, repositorio

institucional de la Universidad Católica de Córdoba, gestionado por el Sistema de Bibliotecas de la UCC.

Esta obra está bajo licencia 2.5 de Creative Commons Argentina.

Atribución-No comercial-Sin obras derivadas 2.5

|®@©I

UNIVERSIDAD CATOLICA DE CORDOBA

Universidad jesuíta

Facultad de Ciencias Químicas

“Relevancia de los rafts en la polaridad neuronal

e implicancias de sus alteraciones en la

enfermedad de Niemann-Pick tipo A"

Tesis para optar al título de Doctor en Bioquímica de la

Universidad Católica de Córdoba

Bioq. Cristian Ariel Galván

Córdoba, 2014

Director de Tesis

PhD. María Dolores Ledesma Muñoz

Científico Titular / Jefe de grupo

Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), España

Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBMSO), España

Co-Director de Tesis

PhD. Dante Miguel Beltramo

Profesor Titular de la Cátedra de Biotecnología

Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Católica de Córdoba

Investigador Principal del CONICET, Argentina

Investigador Principal del CEPROCOR, Argentina

Comisión de Tesis

PhD. Gabriela Paglini

PhD. Gustavo Baiardi

PhD. Roxana Cano

Lugares de Trabajo

Cavalieri Ottolenghi Scientific Institute, Universita degli Studi di Torino, A.O. San

Luigi Gonzaga, Regione Gonzole 10, 10043 Orbassano (Torino), Italia.

Cátedra de Biotecnología, Facultad de Ciencias Químicas,

Universidad Católica de Córdoba.

Parte de este trabajo de

tesis ha sido financiado por una

beca de posgrado otorgada por

la Universidad Católica de Córdoba.

Est a T e ó íó s t á dedicada

amís gueddos P a d e s

y a m í am ada Fa míüía .

“Cada logro es un volver a empezar.

Bendito cada comienzo que nos abre oportunidades

para comunicarnos y poder interactuar.

Muchas gracias a ese mundo de personas,

que en el curso de mi vida y en cada etapa concluida,

me empujaron a volver a empezar.”

Los quiero mucho

C r is t ia n a r i e l g a l v á n

RESUMEN

Relevancia de los rafts en la polaridad neuronal e implicancias de

sus alteraciones en la enfermedad de Niemann-Pick tipo A

Una de las principales características de las neuronas es su extremada

polaridad. La diferenciación tanto morfológica como molecular de

axones y dendritas es necesaria para la función neuronal. Defectos en

esta diferenciación pueden contribuir a la patología de distintas

enfermedades neurológicas. Sin embargo, los mecanismos que

establecen y mantienen la polaridad neuronal y sus implicancias

patológicas no están completamente resueltos. En esta tesis doctoral,

nos hemos centrado en investigar la contribución a la polaridad

neuronal de los dominios de membrana enriquecidos en colesterol y

esfingolípidos, los llamados rafts. Describimos que los rafts son esenciales

para la distribución axonal de moléculas como la proteína del Prion

(PrPC) o el gangliósido GM1 en neuronas hipocampales maduras y

analizamos la contribución a este proceso de sus componentes lipídicos

mayoritarios: el colesterol y los esfingolípidos. Los estudios realizados

apuntan al control de la endocitosis dendrítica como factor clave para

la polarización axonal de moléculas de rafts. Además, caracterizamos

las alteraciones de los rafts en el cerebro y neuronas de un modelo

murino para la enfermedad de Niemann-Pick tipo A (NPA). La actividad

deficiente de la esfingomielinidasa ácida (ASM), que causa la

enfermedad, lleva a la acumulación de la esfingomielina (SM) en la

membrana plasmática neuronal. Demostramos que al alterar los rafts

esta acumulación reduce la endocitosis dendrítica de moléculas como

PrPC y GM1 impidiendo la unión a membrana de la GTPasa RhoA. Esto

tiene como consecuencia la distribución no polarizada de estas

moléculas que aparecen de forma anómala en las dendritas de

neuronas de ratones ASMko. La modulación experimental de los niveles

de SM promueve o previene este fenotipo. En conjunto, los resultados

obtenidos aportan información sobre los mecanismos de polaridad

neuronal y sugieren que defectos en la polaridad pueden jugar un

relevante papel patológico en NPA.

Palabras clave: rafts, polaridad neuronal, esfingomielina, endocitosis,

Niemann-Pick Tipo A.

SUMMARY

Relevance of rafts in neuronal polarity and implications of raft

alterations in Niemann-Pick disease type A

One of the main characteristics of neurons is their extreme polarity.

Morphological and molecular differentiation of axons and dendrites are

necessary for neuronal function. Defects in this differentiation may

contribute to the pathology of neurological diseases. However, the

mechanisms by which polarity is established and mainteined and the

pathological implications of polarity defects are not completely

understood. In this PhD work we have analyzed the contribution to

neuronal polarity of membrane domains enriched in cholesterol and

sphingolipids, the so called rafts. We describe that rafts are required for

the axonal distribution of molecules such as the Prion protein (PrPC) and

the ganglioside GM1 in mature hipocampal neurons. We have analyzed

the contribution to the process of the two main lipid components of rafts:

cholesterol and sphingolipids. Our studies indicate that the control of

dendritic endocytosis is a key event for raft molecule polarization.

Moreover, we have characterized raft alterations in the brain and

neurons of a mouse model for Niemann-Pick disease type A (NPA).

Deficient activity of the acid sphingomyelinase (ASM), which causes the

disease, leads to sphingomyelin (SM) accumulation at the plasma

membrane of neurons. We demonstrate that, through raft alteration, this

accumulation impairs dendritic endocytosis of PrPC and GM1 preventing

the binding to the membrane of the small GTPase RhoA. This, in turn,

leads to the unpolarized distribution of these molecules that remain in

dendrites of ASMko neurons. Experimental modulation of SM levels

promotes or prevents these defects. Altogether the results obtained bring

information on neuronal polarity mechansims and suggest that defects

on them play a relevant pathological role in NPA.

Key words: rafts, neuronal polarity, sphingomyelin, endocytosis,

Niemann-Pick type A.

ÍNDICE

AGRADECIMIENTOS

RESUMEN

SUMMARY

. INTRODUCCION

1.1 La membrana celular: Breve introducción a un sistema dinámico y complejo 1

1.2 Composición de la membrana plasmática celular 3

1.2.1 Bicapa lipídica 4

1.2.2 Componentes lipídicos 5

1.2.3 Componentes proteicos 8

1.2.4 Componentes glucídicos 10

1.3 Microdominios de membrana: Balsas lipídicas (Rafts) como estructuras de 11

membrana altamente organizdas

1.4 Importancia de los rafts en el desarrollo neuronal 15

1.5 Niemann-Pick Tipo A: "Un ejemplo de enfermedad neurológica causada por 19

alteraciones en el metabolismo de lípidos

. HIPOTESIS Y OBJETIVOS

. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Modelo experimental murino

3.2 Reactivos y anticuerpos

3.3 Cultivos celulares: Cultivo primario de neuronas hipocampales provenientes

de rata y ratón

3.4 Estudios realizados con neuronas hipocampales de rata

3.4.1 Purificación de rafts usando Triton X-100

3.4.2 Purificación de rafts por sonicación

3.4.3 Reducción de colesterol 32

3.4.4 Reducción de Esfingolípidos 32

3.4.5 Análisis de la viabilidad celular 33

3.4.6 Análisis lipídico 33

3.4.7 Ensayos de Inmunofluorescencia 34

3.4.8 Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y Western blot 36

3.4.9 Ensayos de endocitosis 37

3.4.10 Ensayos de microscopía electrónica con el uso de anticuerpos 38

3.5 Estudios realizados con neuronas hipocampales de ratón 39

3.5.1 Aislamiento de membranas libres de lisosomas y de fracciones 39

enriquecidas en membranas del aparato de Golgi

3.5.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y Western blot 40

3.5.3 Electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D-PAGE) 41

3.5.4 Análisis de Fosfoproteínas presentes en rafts 43

3.5.5 Aislamiento de rafts de membranas totales o membranas de Golgi 44

3.5.6 Extracción de lípidos y análisis por cromatografía de capa delgada (TLC) 44

y Slot blot

3.5.7 Cuantificación de lípidos por ensayos enzimáticos y HPLC 45

3.5.8 Tratamiento de neuronas hipocampales con SM o Smasa 46

3.5.9 Ensayos de inmunofluorescencia 46

3.5.10 Ensayos de inmunomarcación in-situ 48

3.5.11 Transfecciones, estudio de expresión y tráfico de GFP-GPI 48

3.5.12 Ensayos de endocitosis 49

3.5.13 Ensayos de actividad de RhoA y Cdc42 50

3.5.14 Transfección de RhoA constitutivamente activo 50

3.6 Análsis Estadístico 51

4. DESARROLLO y RESULTADOS

4.1 CAPÍTULO I: Proteína prionica (PrPC) como candidato proteico para analizar

polarización neuronal dependiente de rafts

4.1.1 Análisis de la distribución polarizada de PrPC en neuronas hipocampales

de rata

4.1.2 Asociación de PrPC a rafts en neuronas hipocampales 61

4.1.3 Importancia de los rafts en la distribución axonal de PrPC en neuronas

hipocampales maduras: efecto de la modulación del colesterol

4.1.4 Importancia de los rafts en la distribución axonal de PrPC en neuronas

hipocampales maduras: efecto de la modulación de los esfingolípidos

4.1.5 Papel crítico de los rafts en la endocitosis de PrPC en neuronas

hipocampales maduras

4.2 CAPÍTULO II: Aletaraciones de la polaridad neuronal en la enfermedad de

Niemann-Pick Tipo A: Relevancia de los rafts

4.2.1 Alteraciones en la composición lipídica de los rafts neuronales en

ausencia de ASM

4.2.1.1 Análisis lipídico de rafts provenientes de membranas totales de

cerebros y de cultivos primarios neuronales de ratones wt y ASMko

4.2.1.2 Análisis lipídico de rafts provenientes de membranas de Golgi 90

4.2.1.3 Análisis lipídico de rafts provenientes de membrana plasmática

neuronal

4.2.2 Composición proteica de rafts neuronales en ausencia de ASM 95

4.2.2.1 Análisis proteico de rafts provenientes de membranas totales de

cerebro

4.2.2.2 Análisis proteico de rafts provenientes de cultivos primarios

neuronales

4.3 CAPÍTULO III: Alteraciones de las funciones de rafts, particularmente en la 101

distribución polarizada de proteínas neuronales en ausencia de ASM

4.3.1 Análsis de la distribución polarizada de moléculas de rafts en neuronas

hipocampales de ratones ASMko

101

4.3.2 Análsis del tráfico exocítico del dominio GPI en neuronas hipocampales 108

de ratones ASMko

4.3.3 Análsis de la endocitosis de moléculas de rafts en neuronas

hipocampales de ratones ASMko

111

4.3.4 El aumento de SM es responsable de la endocitosis deficiente de

moléculas de rafts en neuronas hipocampales de ratones ASMko

114

4.3.5 Alteraciones en la unión a membrana de RhoA reducen la endocitosis

de moléculas de rafts en neuronas ASMko

119

. DISCUSIÓN

5.1 Relevancia de los rafts en la polarización axonal: mecanismo molecular

5.2 Polarización axonal de PrPC en neuronas hipocampales: implicancias

fisiológicas y patológicas

123

127

5.3 La ASM como moduladora de la composición proteica y lipídica de la MP:

implicancias para NPA

128

5.4 Modulación de la SM como posible terapia para NPA: efecto en otros

lípidos?

130

6. CONCLUSIÓN FINAL

7. ABREVIATURAS

8. REFERANCIAS

9. PUBLICACIONES

123

134

151

1. INTRODUCCIÓN

1.1 LA MEMBRANA CELULAR: BREVE INTRODUCCIÓN A UN SISTEMA DINÁMICO Y

COMPLEJO.

La membrana plasmática (MP) es una estructura laminada dispuesta como

una bicapa lipídica que delimita todas las células. Está compuesta por lípidos,

proteínas y glúcidos. Esta membrana determina la morfología y contribuye a

mantener el equilibrio entre el interior y el exterior celular (Fig. 1). Gracias a su

permeabilidad selectiva, tiene la capacidad de regular el paso de agua,

iones y metabolitos conservando estable el medio intracelular a la vez que

mantiene el potencial electroquímico. Además, la MP recibe las señales del

exterior celular transfiriéndolas al interior y desencadenando la respuesta a

estímulos (Alberts y col., 2006).

INTRODUCCIÓN | 2

Núcleo

Citoplasma

Figura 1. Ilustración de la membrana plasmática de una célula eucariota. Figura adaptada de

Alberts y col. (2006)

Durante mucho tiempo se creyó que la MP era una simple barrera estática

formada por la sucesión de capas proteínas-lípidos-lípidos-proteínas. Hoy en

día se concibe como una estructura dinámica cuyo modelo se conoce como

INTRODUCCIÓN | 3

“mosaico fluido”, término acuñado por S.J. Singer y G.L. Nicholson en 1972.

Explicar los cambios en la fluidez de las membranas, sus causas y sus

consecuencias ha centrado la atención no sólo de biólogos sino también de

físicos debido a sus fascinantes propiedades. En los últimos años se han

develado un gran número de estructuras moleculares de proteínas de

membrana y principios básicos a los que responde la organización de la MP.

En el escenario actual la MP se concibe como una estructura

compartimentalizada en dominios muy dinámicos de escala nanométrica. En

ella, los lípidos han dejado de considerarse meros elementos estructurales

para pasar a tener un papel activo en dicha compartimentalización, que es

esencial para el tráfico y la señalización intracelular (Gorter & Grendel, 1925;

Engelman, 2005; Jacobson y col., 2007; Coskun & Simons, 2010; Simons &

Sampaio, 2013).

1.2 COMPOSICIÓN DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA CELULAR.

La composición química de la MP varía entre células dependiendo de la

función que ejercen o del tejido en el que se encuentren. De manera general

esta membrana está compuesta por una doble capa de fosfolípidos a la que

se unen proteínas y glúcidos. Las moléculas más numerosas son las de lípidos

estimándose que por cada 50 lípidos hay una proteína. Sin embargo, las

proteínas, debido a su mayor tamaño, representan aproximadamente el 50%

INTRODUCCIÓN | 4

de la masa de la membrana (Alberts y col., 2006) (Fig. 2).

Figura 2. Esquema general de una membrana celular. Según el modelo de mosaico fluido, las

proteínas (en violeta) serían como icebergs que navegarían en un mar de lípidos (en celeste).

Figura adaptada de Alberts y col. (2006)

1.2.1 BICAPA LIPÍDICA.

El orden de las cabezas hidrofílicas y las colas hidrofóbicas de la bicapa

lipídica impide que solutos polares, como sales minerales, agua, carbohidratos

y proteínas, difundan a través de la membrana permitiendo en general la

difusión pasiva de moléculas hidrofóbicas.

La doble capa lipídica de la MP se forma espontánemante gracias a la

propiedad que poseen las mitades hidrofóbicas de los lípidos de asociarse

entre ellas y a la tendencia de las porciones hidrofílicas a interactuar con

ambientes acuosos (Fig. 3). Esta característica anfipática de los lípidos es la

propiedad química que permite a las células aislar su interior y este mismo

principio permite a nivel subcelular el ensamblaje de las membranas de las

organelas.

INTRODUCCIÓN | 5

Figura 3. Diagrama del orden de los lípidos antipáticos para formar una bicapa lipídica. Las

cabezas polares (de color anaranjado) separan las colas hidrofóbicas (de color azul) del

medio citosólico y extracelular.

1.2.2 COMPONENTES LIPÍDICOS.

El 98% de los lípidos presentes en las membranas celulares son anfipáticos. Los

más abundantes son los fosfolípidos y los esfingolípidos (SLs), que se

encuentran en todas las células; le siguen los glicolípidos y los esteroles

(principalmente colesterol).

Los fosfolípidos tienen una molécula de glicerol con la que se esterifica un

ácido fosfórico y dos ácidos grasos de cadena larga; los principales

fosfolípidos de membrana son la fosfatidiletanolamina (PE), la fosfatidilcolina

(PC), el fosfatidilinositol (PI) y la fosfatidilserina (PS) (Alberts y col., 2002).

Los SLs, son lípidos de membrana constituidos por ceramida (esfingosina +

ácido graso); donde solo la familia de la esfingomielina (SM) posee fósforo; el

INTRODUCCIÓN | 6

resto posee glúcidos, por lo que se denominan glucoesfingolípidos. Los

cerebrósidos poseen principalmente glucosa, galactosa y sus derivados (N-

acetilglucosamina y N-acetilgalactosamina). Los gangliósidos contienen una

o más unidades de ácido siálico (Futerman & Hannun, 2004) (Fig. 4).

El colesterol representa un porcentaje importante (en torno al 20% en

células de mamífero) de los lípidos de membrana. Sus moléculas son más

pequeñas y anfipáticas en comparación con otros lípidos entre los que se

intercala. Se dispone con el grupo hidroxilo hacia el exterior de la célula por su

afinidad con el agua. Dadas sus características y abundancia, el colesterol es

un factor clave para controlar la fluidez y permeabilidad de la membrana. A

mayor cantidad de colesterol menos permeable y fluida es la misma.

INTRODUCCIÓN | 7

Fosfolípidos

Ft]— C —0 —CH;

0 I

II I

Fo sfa tid ile ta no la m in a

R-,— C — O — (

Fosfatid ilco lin a

I H2 h2

H?c — o — p—o - c -c -NH-4

R2—C - C - C H

M2 1-2

H2€ — O — R - O - C -C -N(CH3)a"

■ Fo sfatid ilserin a

II 1

r , —a —i —cu

I 0

I II H2 H

h 2c — o — p - o — c - c — n h 3

O' ^

u CÜ O-

Esfingolípidos

11 9

CH _ c = o - c h— h - -

-{CHihi C C C-CH CHS O J C

H O H N H O

+■

j —M(C Hj )j

Esfin go m ielin a

Esteroles

Figura 4. Estructuras químicas de los principales lípidos constitutivos de la membrana

plasmática. Figura adaptada de Blanco A. (2007)

INTRODUCCIÓN |8

De manera general se postula que los lípidos de membrana se podrían

encontrar en dos formas: como un líquido bidimensional o como una

estructura más ordenada formando las llamadas balsas lipídicas (rafts) en las

que el colesterol y los SLs juegan un papel esencial y de las que daremos

detalle más adelante (Mouritsen & Zuckermann, 2004).

Por su protagonismo en esta tesis doctoral merece especial atención la

composición lipídica de las membranas neuronales. Si bien esta composición

puede variar dependiendo del tipo neuronal, las células nerviosas presentan

membranas particularmente enriquecidas en SLs, gangliósidos y colesterol,

(Sonnino & Prinetti, 2013).

1.2.3 COMPONENTES PROTEICOS.

Las proteínas de la MP son responsables de funciones tales como transporte,

adhesion, recepción y transducción de señales, proteolisis o catálisis

(enzimas). Se pueden clasificar según el modo de disposición en la bicapa

lipídica como:

-1- Proteínas integrales: Embebidas en la bicapa lipídica atravesando la

membrana una o varias veces (proteínas transmembrana) o mediante

enlaces covalentes con un lípido o un glúcido. Estas proteínas

representan aproximadamente el 80% de las proteínas de membrana.

-I- Proteínas periféricas: A un lado u otro de la bicapa lipídica se unen

débilmente a la membrana por enlaces no covalentes. Entre ellas, se

encuentran proteínas que incorporan a su molécula una modficación

INTRODUCCIÓN | 9

lipídica como el grupo glicosil fosfatidil inositol (GPI) o el ácido palmítico.

Estas proteínas representan el 20% de las proteínas de membrana.

La distribución de las proteínas en la MP es clave para su función y en

muchos casos, esta distribución no es homogénea sino polarizada. Las

neuronas, tipo celular que centra el presente trabajo de tesis, son el

paradigma de la polaridad celular y la especialización a nivel de membrana.

Este tipo celular posee dos tipos de procesos, molecular y funcionalmente

distintos, los axones y las dendritas, que tienen además dominios

especializados como la sinapsis. En las neuronas, el alto grado de polarización

produce la especificación local de sus funciones, en sitios eventualmente

muy lejanos, como ocurre por ejemplo en las neuronas del tracto cortico-

espinal (Horton & Ehlers, 2003). A establecer la organización de las

membranas dendríticas y axonales contribuyen el transporte polarizado, la

fusión a MP y la retención selectiva. Muchas proteínas sinápticas están

fuertemente retenidas en la MP gracias a sistemas de “andamiaje” en el que

participan proteínas del citoesqueleto (Bork y col., 1997; Ledesma & Dotti,

2003; Leenders y col., 2008). Sin embargo, otras proteínas polarizadas en

axones o dendritas no presentan esta fuerte retención y no están aún claros

los mecanismos que impiden su difusión lateral de un dominio al otro. Aunque

se postula la existencia de una barrera (Kobayashi y col., 1992; Futerman y

col., 1993; Winckler y col., 1999) no está aún clara la naturaleza de la misma

como es el caso de las uniones estrechas, conocidas como “tight junctions”,

INTRODUCCIÓN | 10

en las células epiteliales (Stevenson & Keon, 1998).

El análisis de neuronas hipocampales en cultivo que desarrollan axones y

dendritas de manera secuencial y estereotipada ha sido y sigue siendo muy

útil para entender las señales iniciales y las vías de establecimiento de la

polaridad neuronal como se describirá más adelante (Kunda y col., 2001,

González-Billault y col., 2002; Calderon de Anda y col., 2008; Leach y col.,

2011; Dupraz y col., 2009; Sachdev y col., 2007).

1.2.4 COMPONENTES GLUCÍDICOS.

Estos componentes se encuentran en el exterior de la membrana formando el

glicocalix. Se unen covalentemente a las proteínas o a los lípidos. Pueden ser

polisacáridos u oligosacáridos y sus principales funciones son dar soporte a la

membrana y el reconocimiento celular (Alberts y col., 2006).

INTRODUCCIÓN | 11

1.3 MICRODOMINIOS DE MEMBRANA: BALSAS LIPÍDICAS (RAFTS) COMO

ESTRUCTURAS DE MEMBRANA ALTAMENTE ORGANIZADAS.

Además de macrodominios diferenciados como son los axones, las dendritas

o la sinapsis, las membranas neuronales (y las de todas las células) cuentan

también con una compartimentalización a micro/nano escala. La afinidad

química que existe entre determinados lípidos, SLs y colesterol, que los lleva a

asociarse formando nanodominios que incorporan proteínas de manera

selectiva, es la base del concepto de balsa lipídica o raft.

La primera función asignada a los rafts fue la de contribuir a la generación

de la membrana apical de las células epiteliales rica en glicolípidos (Simons &

Van Meer, 1988). Durante mucho tiempo la existencia de rafts en células vivas

fue cuestionada ya que resultaba muy difícil visualizarlos por microscopía

convencional debido a su reducido tamaño y gran dinamismo. Sin embargo

el uso de nuevas técnicas y herramientas, como por ejemplo la toxina

colérica que se une al gangliósido enriquecido en rafts GM1, colorantes

lipófilos que detectan el grado de fluidez de la membrana como el Laurdan,

o técnicas que permiten analizar la interacción y dinamismo de proteínas

marcadas como FRET (fluorescence resonance energy transfer), FRAP

(fluorescence recovery after photobleaching), SFTM (single fluorophore

tracking microscopy) o SPFT (single particle fluorescence tracking) han

permitido confirmar la existencia de los rafts en células vivas (Munro, 2003;

Sonnino & Prinetti, 2013). Gracias a estos estudios se ha llegado a la

elaboración de simuladores virtuales que interpretan la formación y la

INTRODUCCIÓN | 12

relevancia fisiológica de los rafts en distintos tipos celulares (Abe y col., 2012;

Toulmay & Prinz, 2013; Bennett & Tieleman, 2013).

El método más extendido para el estudio de estas balsas lipídicas sigue

siendo sin embargo una técnica bioquímica basada en una característica

física de estos complejos de membrana: su resistencia a la extracción con

detergentes no iónicos a baja temperatura (4°C). El uso de distinos

detergentes (por ejemplo, Triton X-100, CHAPs, Lubrol, Triton X-114) en frío y el

fraccionamiento en gradientes de densidad permiten obtener las membranas

resistentes a detergentes (DRMs o rafts) en las fracciones ligeras del gradiente.

Este comportamiento se debe a la composición lipídica rica en SLs, colesterol

y el gangliósido GM1. Entre las proteínas con afinidad por rafts que se

obtienen en las fracciones ligeras después de la extracción en frío con

detergentes, están las ancladas a la membrana a través del grupo GPI, las

doblemente acetiladas y asociadas al colesterol, y proteínas palmitoiladas

(Schroeder y col., 1994; Hanada y col., 1995; Scheiffele y col., 1997; Simons &

Toomre, 2000).

En la actualidad, se acepta la definición de rafts establecida en el año

2006 durante el Keystone Symposium of Lipid Rafts and Cell Function: “Las

balsas lipídicas de membrana o rafts son pequeños dominios de entre 10 y 200

nm, heterogéneos y muy dinámicos, enriquecidos en SLs y esteroles, que

compartamentalizan los procesos celulares. A veces, estas pequeñas balsas se

estabilizan y forman estructuras más grandes mediante interacciones proteína-

proteína y proteína-lípido” (Fig. 5).

INTRODUCCIÓN | 13

Proteína anclada por GPI

Proteína Tírosínkínasa Proteína de Transmembrana

Figura 5. Diagrama simplificado de un raft lipídico.

Los rafts se ensamblan en la región trans del aparato de Golgi (TGN)

donde se producen los SLs y entran en contacto con el colesterol

previamente sintetizado en el retículo endoplásmico y transportado luego al

TGN. El alto contenido en ácidos grasos saturados confiere a las membranas

de rafts más orden y menos fluidez teniendo una temperatura de fusión más

alta que otras zonas de la membrana (Harder y col., 1998). Ese alto grado de

empaquetamiento de las cadenas aciladas es esencial para la organización

de estos microdominos de membrana ya que hace que estas regiones ricas

en SLs formen una fase “líquida ordenada” (Lo) rodeada por dominios ricos en

glicerofosfolípidos que constituyen una estructura “líquida desordenada” (Ld),

(Munro, 2003; Lucero & Robbins, 2004) (Fig. 6).

INTRODUCCIÓN | 14

MEC

Citosol

mam

flÉW

i m

Raft

Proteínas

transmembrana

f f l lípidos t-.V‘ " " “ ‘cos

*•: Proteína con

v anclaje GPI

Glicolípido Colesterol

Figura 6. Esquema de una balsa lipídica o raft de membrana. En la figura se muestran

algunos de los principales componenetes de la membrana plasmática, y cómo éstos se

organizan, interaccionan entre ellos y forman las balsas lipídicas. Figura gentilmente cedida

por Natalia Díez Revuelta.

Los rafts están implicados en muchos procesos celulares; participan no solo

en el correcto transporte de proteínas desde el TGN hacia la membrana

plasmática, sino también en ciertos procesos de endocitosis, transducción de

señales, proteólisis, adhesión celular y migración, transmisión sináptica y en la

organización del citoesqueleto (Simons & Ikonen, 1997; Hancock, 2006; Orlandi

& Fishman, 1998; Parton & Richards, 2003; Sonnino & Prinetti, 2013).

INTRODUCCIÓN | 15

1.4 IMPORTANCIA DE LOS RAFTS EN EL DESARROLLO NEURONAL.

La maduración neuronal es un proceso gradual, donde el axón y las dendritas

se diferencian primero morfológicamente para después adquirir una

composición molecular distinta que les permite llevar a cabo sus diferentes

funciones. Sólo luego de adquirir la polarización molecular de la membrana

plasmática la neurona podrá establecer sinapsis (Dotti y col., 1988).

Los diferentes cambios morfológicos y moleculares que ocurren durante la

diferenciación neuronal, desde que son células redondas hasta el desarrollo

de complejas ramificaciones dendríticas y axonales, han sido caracterizados

en detalle en cultivos primarios de neuronas hipocampales derivados de

embriones de ratón o rata (Craig & Banker, 1994; Dotti y col., 1988; Calderon

de Anda y col., 2008; Leach y col., 2011).

Hasta llegar a su madurez, las neuronas hipocampales en cultivo pasan

por 5 estadíos diferenciables morfológicamente (Fig. 7). En el estadío inicial

inmediatamente posterior a la disección, las neuronas hipocampales tienen

una morfología redonda sin ningún tipo de procesos (Estadío 1). En el curso de

las siguientes 4 - 24 horas varios procesos con características morfológicas y

longitudes similares emergen del cuerpo celular (Estadío 2). Entonces, uno de

los procesos empieza a elongar más rápido gracias a un mayor transporte de

organelas de membrana y proteínas citosólicas (Bradke & Dotti, 1997),

mientras los demás permanecen estacionarios, y si nada lo impide este

proceso se convertirá posteriormente en el axón (Dotti & Banker, 1987). Esta

etapa es conocida como Estadío 3 del desarrollo neuronal y constituye el

INTRODUCCIÓN | 16

primer signo de polarización. El estadío 4 del desarrollo comienza después de 4

días en cultivo e implica la elongación tanto axonal como dendrítica. A este

punto, proteínas del citoesqueleto como la proteína asociada a microtúbulos

MAP2, comienza a ser segregada a los procesos dendríticos (Caceres y col.,

1984). Las neuronas en estadío 5 (desde los 7 días en cultivo en adelante)

tienen procesos axonales y dendríticos largos y muy ramificados con

numerosos contactos intercelulares (Fig. 8). En este momento, proteínas del

citoesqueleto como MAP2 y tau, y ciertas proteínas de membrana dendrítica

presentan distribución polarizada (Caceres y col., 1984; Craig y col., 1994; Rao

y col., 1998). La segregación molecular, al igual que la restricción de ciertas

proteínas de superficie y la agrupación de los receptores de neurotransmisores

y canales iónicos necesarios para la actividad sináptica, tiene lugar a partir de

los 13 - 15 días en cultivo y sólo entonces la neurona es totalmente funcional

(Craig y col., 1994). Por ello se asume que la asimetría funcional de la

membrana neuronal ocurre a través de la maduración de dos mecanismos

del desarrollo: primero la maduración de la vía del transporte polarizado de

componentes de membrana y posteriormente el anclaje y agrupamiento de

los mismos en la superficie celular.

INTRODUCCIÓN | 17

Figura 7. Establecimiento de la polaridad en neuronas hipocampales en cultivo. Se

indica para cada estadío, el tiempo aproximado al cual se puede encontrar cada

fase expresado en días en cultivo, así como la morfología característica de cada uno.

Figura adaptada de Dotti y col. (1998)

Estadio 4

Figura 8. Imágenes representativas de los distintos estadíos del desarrollo neuronal. Neuronas

hipocampales en cultivo provenientes de cerebros de embriones de rata de 18 días de

gestación. Las barras blancas indican 10 Imágenes gentilmente cedidas por María

Dolores Ledesma Muñoz.

En neuronas, el establecimiento de los rafts es necesario para una correcta

maduración y mantenimiento del transporte polarizado de ciertas proteínas

hacia la membrana axonal. Así, la reducción farmacológica de los niveles de

colesterol o SLs en neuronas maduras suprime la polarización axonal de

INTRODUCCIÓN | 18

proteínas como la GPI Thy-1 (Ledesma y col., 1998). Además, el aumento de la

síntesis de esfingomielina durante el desarrollo es clave para la formación de

rafts y el estableciemiento de la polaridad axonal de esta proteína (Ledesma

y col., 1999). Es también importante destacar que los rafts participan en el

transporte polarizado de proteínas en otros tipos celulares de cerebro tales

como oligodendrocitos. De hecho, ciertas proteínas constitutivas de la capa

de mielina necesitan de éstos microdominios para asociarse con la misma

(Kramer y col., 1997).

A pesar de que hay evidencias de la participación de los rafts en el

desarrollo y funcionamiento neuronal, aun no se conocen en detalle los

mecanismos moleculares de esta participación, cuál es la contribución de los

distintos lípidos de rafts, qué proteínas utilizan este mecanismo y si alteraciones

de rafts que afectan a la polaridad neuronal están involucrados en la

patología de enfermedades neurológicas (Ledesma y col., 1998; Simons &

Ikonen, 1997; Ledesma y col., 2011). Por ello, esta tesis doctoral se ha centrado

en aportar información sobre estas cuestiones.

INTRODUCCIÓN | 19

1.5 NIEMANN-PICK TIPO A: UN EJEMPLO DE ENFERMEDAD NEUROLÓGICA

CAUSADA POR ALTERACIONES EN EL METABOLISMO DE LÍPIDOS.

De acuerdo con un papel relevante de los lípidos en el funcionamiento

neuronal muchas lipidosis cursan con problemas cognitivos, retardo mental y

neurodegeneración. Entre ellas están las esfingolipidosis provocadas por

alteraciones en el metabolismo de SLs que son componentes esenciales de los

rafts. La enfermedad de Niemann-Pick tipo A y B (NPA y NPB) es una

esfingolipidosis causada por mutaciones en el gen SMPD1 que codifica para

la esfingomielinidasa ácida (ASM) (Brady y col., 1966). Ambos tipos se

caracterizan por un progresivo compromiso visceral, incluyendo

hepatoesplenomegalia, insuficiencia respiratoria y enfermedad

cardiovascular (Schuchman & Desnick, 2001). Sin embargo, mientras el NPB

tiene manifestaciones tardías y presenta leve o incluso ningún compromiso

neurológico, el NPA es la forma infantil caracterizada por deficiencias

cognitivas severas y por un proceso neurodegenerativo que conduce a la

muerte en los primero 3 - 4 años de vida. La presentación clínica diferente

entre ambos tipos de la enfermedad se debe a diferencias en la actividad

enzimática residual de la ASM. Mientras la actividad residual en NPB está

reducida pero es aún superior a un 5% de la actividad normal, en NPA la

actividad residual es menor al 1% de la normal (Graber y col., 1994). Estas

observaciones sugieren que mientras niveles bajos de actividad enzimática

son suficientes para mantener intacta la función neurológica, la ausencia

total de la misma tiene consecuencias devastadoras en el cerebro.

INTRODUCCIÓN | 20

La ASM es una enzima lisosomal que convierte a la SM en ceramida y

fosfocolina (Gatt, 1963; Fowler, 1969). Por lo tanto, la acumulación de SM en

los lisosomas caracteriza a las células de los pacientes con enfermedad de

Niemann-Pick (NPD), tanto tipo A como B, clasificando a esta patología como

una metabolopatía de depósito lisosomal (Futerman & van Meer, 2004). Se

supone que el almacenamiento lisosomal tiene lugar sólo cuando la actividad

residual de la enzima ASM cae por debajo de un umbral crítico donde la tasa

de degradación del sustrato es inferior a la tasa de recaptación (Conzelmann

& Sandhoff, 1983). La recaptación de SM en células neurales es menor que en

hígado, bazo o linfonodos y por ello se ha propuesto que los niveles bajos de

actividad enzimática en la enfermedad NPB son suficientes para impedir el

almacenamiento lisosomal en neuronas (Graber y col., 1994), evitando de

esta manera el severo compromiso neurológico.

Desafortunadamente, a pesar de esta correlación entre la actividad

enzimática residual y el fenotipo, los ensayos realizados in-vitro para medir la

actividad de la ASM no han sido suficientes para predecir el desarrollo y la

magnitud del compromiso neurológico en los pacientes con NPA. Más aún,

aunque el almacenamiento lisosomal de sustrato no metabolizado ha sido

considerado la causa principal de la enfermedad, el mecanismo molecular

que conduce a este evento patológico con compromiso neurológico aún se

desconoce.

Es muy probable que este defecto enzimático, considerado como

primario, desencadene muchas alteraciones bioquímicas y celulares

secundarias que podrían conducir a complicaciones mayores o incluso ser la

INTRODUCCIÓN | 21

principal causa del daño tisular y la muerte del paciente. Los SLs, incluida la

SM, ejercen muchas de sus funciones biológicas a nivel de la MP donde,

como ya se ha comentado, modulan la organización lateral de la membrana

afectando la función de las proteínas asociadas (Lingwood & Simons, 2010).

Por lo tanto, la deficiencia lisosomal de la ASM y el defecto resultante en el

catabolismo a nivel de esta organela podrían directamente conducir a una

alteración en la composición y funcionamiento de la MP. Por otro lado, se ha

demostrado la presencia de una reserva de ASM en la superficie celular

(Grassmé y col., 2001; Gulbins, 2003) sugiriendo que independientemente del

defecto lisosomal, las alteraciones de la MP podrían deberse directamente al

defecto enzimático en este sitio celular. Un objetivo importante de esta tesis

ha sido investigar esta posibilidad.

Para ello, hemos utilizado un modelo animal (murino) para NPA creado por

técnicas de transferencia genética. En estos ratones el gen SMPD se truncó

(ratones ASMko) por lo que no se expresa la ASM, lo cual lleva a la ausencia

total de actividad de la enzima en todos los tejidos incluido el cerebro. Este

modelo presenta los mismos síntomas que los pacientes con NPA entre los que

se encuentran: el declive motor progresivo que deriva en ataxia,

neurodegeneración y muerte temprana (a los 7 - 8 meses de edad)

(Horinouchi y col., 1995). En el cerebro de estos ratones la falta de ASM lleva a

la acumulación de la SM que es uno de los principales componentes de rafts.

Por ello consideramos que el ratón ASMko es una herramienta ideal para

estudiar tanto in-vitro como in-vivo la repercusión de alteraciones de rafts en

la polaridad neuronal y su posible contribución al desarrollo de la NPA, que

hoy en día no tiene cura ni tratamiento, causando deficiencias cognitivas

severas.

INTRODUCCIÓN | 22

2. HIPÓTESIS y OBJETIVOS

Considerando el marco teórico descripto proponemos como hipótesis de

trabajo que la falta de actividad de la ASM provoca dos situaciones aberrantes

que producen alteraciones en los rafts. Por una parte, existe un bloqueo de la

producción de ceramida a partir de SM en los lisosomas. Esto disminuye la

cantidad de ceramida disponible en el TGN para sintetizar de novo SM, lo que

conduce a una menor formación de rafts.

Por otro lado, la falta de actividad de ASM a nivel de la membrana

plasmática provoca un aumento de la cantidad de SM a ese nivel alterando la

composición y las funciones de los rafts en la superficie celular.

Para el abordaje de ésta hipótesis de trabajo con dos escenarios, nos

planteamos los siguientes objetivos:

OBJETIVO GENERAL:

Comprender los mecanismos moleculares por los que los rafts participan en la

polaridad neuronal y determinar si alteraciones en estos mecanismos

contribuyen a la patología de la enfermedad de Niemann-pick tipo A.

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS | 24

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

-I- Caracterizar marcadores proteicos neuronales cuya polarización depende

de rafts.

-I- Determinar el mecanismo de la polarización dependiente de rafts.

-I- Caracterizar las alteraciones en la composición lipídica y proteica de los

rafts neuronales en el ratón modelo para NPA que carece de ASM.

-I- Determinar si la polarización dependiente de rafts se ve afectada en

neuronas carentes de ASM, y si es así, caracterizar el mecanismo molecular

aberrante.

-I- Ensayar estrategias de rescate de los fenotipos aberrantes.

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 MODELO EXPERIMENTAL MURINO.

Una colonia de ratones heterocigotas para el gen codificante de la ASM

(Cg5BL) (Horinouchi y col., 1995) se estableció a partir de dos parejas

gentilmente donadas por el dr. Schuchman (Mount Sinai School of Medicine,

New York). Los experimentos se realizaron usando ratones wt o ASMko de 7

meses de edad, cuyo genotipo se determinó a partir de ADN genómico

mediante reacción de PCR según fue descripto por Horinouchi y col. (1995).

Todos los procedimientos que necesitaron el uso de animales fueron

supervisados por el veterinario encargado del bioterio, siguiendo las guías de

protección y bienestar animal publicadas por el Ministerio de Salud Italiano

(DDL 116/92).

MATERIALES Y MÉTODOS | 26

3.2 REACTIVOS y ANTICUERPOS.

Cultivos: • DMEM, Glucosa, HEPES, KH2PO4, L-Glutam¡na, MEM, •Sigma-Aldrich

MgSO4, NaCl, NaHCO3, NGF, Poly-L-Lisina, Tripsina

• CaCI2, KCI, MgCh, Na2HP04 «Merck

• Neurobasal, Penicilina-Estreptomicina, Suero de • Invitrogen

Caballo, Suero fetal bovino (FBS), Suplemento B27

Tratamientos:

Tinción /n-situ e

Inmunofluorescencias

• Subunidad p> de la toxina colérica conjugada con

Fluoresceina, Fumonicin B (FB1), SM, Simase,

Methyl-p>-cyclodextrin (Mp>C), Mevilonin

• FM4-64

• Ácido pirúbico (C

3 H4O3), BSA, Cloruro de Amonio

(NH4Cl), DABCO, EGTA, Glucosa, Hepes, KH2 PO4,

Lactosa, Laminina, L-Glutamina, NaCl, NaHCO3,

Sacarosa, Triton X-100

• Gelatina 80-100 blooms, PFA

• Suero fetal bovino (FBS)

• Ácido tricloroacético (TCA), KCl, Metanol, Na2HPO4

• Mowiol

• Parafina

• Sigma-Aldrich

• Molecular Probes

> Sigma-Aldrich

• Panreac

• Invitrogen

• Merck

• Calbiochem

• Fluka

Bioquímica • Acrylamida/bis-Acrylamida, Azul de bromofenol, CLAP,

EDTA, Glucosa, Glicina, Glycerol, Hepes, MES, NaCl, NaHCO3,

•

Sigma-Aldrich

NP-40, Sacarosa, Triton X-100; Trizma base, Tween-20,

B-mercaptoetanol (p>-ME)

• Ácido clorhídrico (HCl), CaCk, Cloroformo, Deoxicolato

•

Merck

Sódico, KCl, Metanol, MgCk

• SDS

•

GE-Healthcare

• DSP, DTSSP

•

Pierce

• APS, TEMED

•

Bio-Rad

Tabla 1. Reactivos. En la tabla se muestra un listado de los reactivos empleados para la

realización del presente trabajo distribuídos por técnicas de experimentación (cultivos celulares,

tratamientos, ensayos

¡n-s¡fu e inmunocitoquímica y bioquímicos), y ordenados en función de la

casa comercial de la que son originarios.

MATERIALES Y MÉTODOS | 27

Nombre Especie Concentración Origen

Y-Adaptin Ratón 1:5000 BD Biosciences

Bip Ratón 1:2500 BD Biosciences

GM-130 Ratón 1:500 BD Biosciences

Lamp-2 Ratón 1:250 BD Biosciences

Synaptophysin Ratón 1:50 Chemicon

clon Sy-38

Anti-TfRc Conejo 1:50 Sta. Cruz Biotechnology

clon CD-71

APP Ratón 1:100 Chemicon

clon 22C11

Flotillin-1 Ratón 1:100 BD Biosciences

PrPC (Pom-1) Ratón 1:100

Gentilmente provisto por

Dr. A. Aguzzi (Institute of

clon Ag1193

Neuropathology, Zurich,

Switzerland)

MAP2 Conejo 1:2000 Peninsula Laboratories

RhoA Ratón 1:200 Sta. Cruz Biotechnology

clon 26C4

Cdc-42 P1 conejo 1:200 Sta. Cruz Biotechnology

a-Tubulin Ratón 1:2000 Sigma

Tau-1 Ratón 1:1000 Millipore

clon PC1C6

Thy-1 (CD-90) Ratón 1:100 Serotec

Anti-GluR1 Conejo 1:50 Upstate

Anti-MBP Ratón 1:200 Thermo Scientific

Tabla 2. Anticuerpos primarios. En la tabla se muestra un listado de los anticuerpos primarios

empleados para la realización de inmunofluorescencias indicando el nombre completo del

anticuerpo, la especie animal reactiva, la concentración empleada y la casa comercial de la

que son originarios.

Para Western blots, los anticuerpos anti PrPc, a-Tubulin y Flotillin-1 se usaron

diluídos 1:500. La subunidad p de la toxina colérica (Sigma) se usó diluida 1:1000

en los slot-blots.

MATERIALES Y MÉTODOS | 28

Se utilizaron anticuerpos secundarios anti-especie (Molecular Probes)

conjugados con diferentes fluoróforos Alexa Fluor 488, 594 o 647 (1:1000) para

las inmunofluorescencias o conjugados con HRP (1:2000) para WB.

3.3 CULTIVOS CELULARES.

Cultivo primario de neuronas hipocampales provenientes de rata y ratón.

Los cultivos de neuronas hipocampales de rata o ratón se obtuvieron a partir de

embriones de 18 o 16 días de gestación (E18, E16, respectivamente) según el

protocolo descripto por Goslin y Banker en 1989 (Goslin & Banker, 1989; Kaech &

Banker, 2006). El motivo por el que se eligieron células de E18 o E16 es porque

en estos estadíos la gran mayoría de las neuronas hipocampales de rata o

ratón, respectivamente, han finalizado su división celular pero la diferenciación

no ha acabado completamente encontrándose en el momento ideal para el

estudio de su desarrollo (Dotti y col., 1988).

Para la obtención de estas células se extrajo el cerebro de los embriones y

se diseccionó el hipocampo; el tejido se limpió de restos de meninges y se lavó

con solución tamponada de Hank libre de iones Ca2+ y Mg2+, atemperada a

37°C (HBSS sin Ca2+/Mg2+; compuesto por 137mM NaCl, 5.36mM KCl, 0.34mM

Na2HPO4, 0.44mM KH2PO4, 4.2mM NaHCO3, 5.6mM glucosa, pH 7.4). El tejido

limpio se disgregó mecánicamente con una pipeta Pasteur de vidrio y se trató

MATERIALES Y MÉTODOS | 29

con tripsina durante 15 minutos a 37°C. Se hicieron lavados de nuevo con HBSS

con iones Ca2+ y Mg2+ (HBSS; compuesto por 137mM NaCl, 5.36mM KCl, 1.26mM

CaCl2, 0.5mM MgCl2, 0.4mM MgSO4, 0.34mM Na2HPO4, 0.44mM KH2PO4, 5.6mM

glucosa, 0.7% Hepes, pH 7.4), y se cuantificó el número de células por mililitro

con una cámara de Neubauer (Brand).

Las células disgregadas se sembraron en placas de Petri de 60 milímetros

(Nunc) para los estudios de bioquímica o en placas con cubreobjetos (CVs) de

vidrio (Marienfeld) para los estudios de microscopía, ambos recubiertos con

Poly-L-Lysina (PLL, Sigma). El recubrimiento de las placas de Petri se realizó por

incubación con una suspensión de PLL 0.1 mg/mL durante 12 horas a 37°C. Para

el recubrimiento de los CVs se utilizaron vidrios secuencialmente tratados con

ácido nítrico (al 50% V/V), lavados con agua destilada y esterilizados por calor

seco durante 2 horas a 200°C. Sobre la superficie de cada CV se aplicaron tres

pequeñas gotas de parafina equidistantes. Una vez seca la parafina, se

recubrieron con una suspensión de PLL 1 mg/mL durante 12 horas a 37°C. Tras

varios lavados con agua destilada el material quedó listo para los cultivos

celulares (Fig. 57, paso 1).

Las suspensiones celulares se sembraron a una densidad de 15x104 células

por placa de 60 milímetros con o sin CVs y se mantuvieron en medio mínimo

esencial (MEM; minimal essenfial médium) suplementado con 10% de suero de

caballo (MEM-HS) y 0,6% de glucosa, en un incubador con atmósfera húmeda

(modelo C150, Binder) al 5% de CO2 y 37°C. A las 24 horas los CVs se

traspasaron a una nueva placa en posición invertida de forma que las gotas de

parafina quedaron en contacto con el plástico. La placa contenía medio

MATERIALES Y MÉTODOS | 30

Neurobasal suplementado con 2% B-27 y 0.5 mM de L-Glutamina (NB-B27)

previamente atemperado y equilibrado a 5% de CO2 (Fig. 57, paso 2).

Para nuestros experimentos, las células se mantuvieron en cultivo por 3 días

(neuronas inmaduras en estadío 3), o por 8 -15 días (neuronas maduras en

estadío 5).

FIGURA 57. Esquema del proceso de disección y cultivo primario de neuronas hipocampales. En

el paso 1 se describe la preparación de CVs de vidrio recubiertos de PLL con gotas de parafina

para el cultivo de neuronas. En el paso 2 se representa el proceso de extracción de

hipocampos y la obtención y siembra de neuronas hipocampales sobre los CVs previamente

preparados. Figura adaptada de Kaech & Banker (2006) y gentilmente cedida por Natalia Díez

Revuelta.

MATERIALES Y MÉTODOS | 31

3.4 ESTUDIOS REALIZADOS CON NEURONAS HIPOCAMPALES DE RATA.

3.4.1 Purificación de rafts usando Triton X-100.

Las neuronas hipocampales se lavaron en tampón fosfato (PBS) en frío y se

extrajeron con tampón MBS (25 mM MES, 150 mM NaCl, pH 6,5) y CLAP (25

|jg/mL de cada uno de los siguientes inhibidores de proteasas: quemostatina,

leupeptina, antipaina y pepstatina) conteniendo 1% Triton X-100. Luego de 60

minutos de incubación a 4°C en agitación, se cuantificó la cantidad de

proteína total empleando un kit comercial basado en el método del ácido

bicinconínico (BCA, Bio-Rad Protein Assay Kit). A 1 ml de muestra conteniendo

100 jg de proteínas se le añadieron 2 mL de sacarosa al 90% P/V para llegar a

una concentración final de 60% P/V sacarosa. La mezcla se depositó en el

fondo de tubos de ultracentrífuga de 12 mL de capacidad (Beckman Coulter).

Sobre estas muestras, se añadieron 4 mL de sacarosa al 35% P/V y 4 mL más al

5% P/V, cuidando que no se mezclaran entre sí para formar un gradiente

discontinuo de densidad. Los tubos se ultracentrifugaron a 155.000 x g durante

18 horas a 4°C (Optima L-100 XP Ultracentrifuge, rotor SW-41, Beckman Coulter).

Partiendo de la superficie del líquido en los tubos se recogieron 11 fracciones

de 1 mL cada una. Las fracciones 4 - 5 se identificaron como fracciones de

rafts por la presencia de marcadores específicos de estos dominios de

membrana en muestras control.

MATERIALES Y MÉTODOS | 32

3.4.2 Purificación de rafts por sonicación.

Como método alternativo al aislamiento de rafts con detergentes se utilizó en

algún caso el aislamiento por sonicación según lo descripto en Smart y col.,

1995. Neuronas hipocampales en cultivo se lavaron en tampón fosfato (PBS) frío

y se recogieron en 1 mL de tampón MBS. Las células se homogeneizaron por

medio de 10 pasajes a través de una aguja 22-G y se sonicaron usando el 130-

W Ultrasonic Processor programado a un ritmo de 12 ráfagas de 5 segundos

cada una. El homogenato se fraccionó en gradiente de sacarosa como se

describió con anterioridad.

3.4.3 Reducción de colesterol.

La reducción de colesterol en neuronas hipocampales se llevó a cabo tratando

las células a los 5 días en cultivo con 0,4 jM Mevilonina y 0,5 mM Metyl-p-

Ciclodextrina (MpC) durante 5 días.

3.4.4 Reducción de Esfingolípidos.

La reducción de SLs en neuronas hipocampales se llevó a cabo agregando, a

las 24 horas desde el plaqueo, fumonisina B1 (FB1) de una solución stock 1 mM

en 20 mM HEPES, pH 7,4 hasta alcanzar una concentración final de 25 jM. Las

células se trataron durante un total de 8 días añadiendo FB1 25jM cada 48

horas.

MATERIALES Y MÉTODOS | 33

3.4.5 Análisis de la viabilidad celular.

La ausencia de cambios en parámetros como la morfología neuronal, la

concentración total de proteínas de membranas (40 ± 9 jg de proteína/100.000

células) y la polarización molecular de componentes del citoesqueleto o

sinápticos se utilizaron para descartar la toxicidad de los tratamientos. Con el

mismo fin se midieron los niveles de apoptosis y necrosis en un total de 100

células por condición y experimento. La apoptosis se cuantificó por ensayo de

TUNEL (Estus y col., 1997). Los niveles de apoptosis fueron muy similares en los

casos control, neuronas tratadas con reductores de colesterol y neuronas

tratadas con reductores de SLs: 10 ± 2,6%, 8 ± 2% y 12 ± 3,1%, respectivamente.

La necrosis se evaluó mediante la incorporación de Trypan blue (Goslin &

Banker, 1991). Los porcentajes de neuronas positivas para Trypan blue no

mostraron diferencias significativas entre células control, tratadas con

reductores de los niveles de colesterol y tratadas para la disminución de los

niveles de SLs (5 ± 1,5%, 4 ± 1,8% y 6 ± 2%, respectivamente).

3.4.6 Análisis lipídico.

Con el objetivo de comparar el contenido lipídico de rafts y extractos totales

provenientes de neuronas de rata en estadío 3 y 5 del desarrollo y monitorear la

eficiencia de los protocolos de reducción de colesterol y SLs, los niveles de estos

lípidos fueron analizados por cromatografía de capa delgada (TLC). Las

membranas celulares fueron obtenidas por centrifugación a 100.000 x g a 4°C

por una hora y los lípidos fueron extraídos de acuerdo al protocolo descripto

MATERIALES Y MÉTODOS | 34

por Bligh and Dyer (1959). Brevemente, las membranas se extrajeron en tampón

Bligh-dyer (metanol/cloroformo [2:1 V/V] con butilhidroxitolueno (BHT) al 0,05%

en etanol). Luego de agitar con vortex y centrifugar la fase orgánica

(cloroformo) se lavó con cloruro de potasio (KCl) 2 M y se centrifugó. El

precipitado se concentró bajo corriente de Nitrógeno. Los extractos lipídicos se

analizaron en placas de silica gel 60 HPTLC usando secuencialmente dos

solventes: Solvente hidrofílico compuesto por cloroformo/acetona/ácido

acético/metanol y agua en proporciones [50:20:10:10:5 V/V]; y solvente

hidrofóbico constituído por hexano y acetato de etilo, en proporciones [5:2

V/V]. Estándares para colesterol, ceramida, SM y fosfolípidos (Fosfatidilcolina,

fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina) se cargaron en paralelo para identificar

estas especies en las muestras biológicas de interés. Los niveles del gangliósido

GM1 se determinaron por slot blot usando la subunidad p de la toxina colérica

conjugada con peroxidasa.

La cuantificación de los resultados, obtenidos en un mínimo de 3

experimentos independientes para cada condición, se realizó sobre imágenes

de TLCs o slot blots tomadas con escaners en condiciones de señal no saturada

sando el software Image J de NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/).

3.4.7 Ensayos de Inmunofluorescencia.

Los ensayos de inmunofluorescencia realizados sobre neuronas permeabilizadas

(incubadas con Triton X-100 al 0,1% durante 5 minutos a temperatura

ambiente), o neuronas extraídas con detergente no iónico a baja temperatura

(incubadas con Triton X-100 al 1% por 5 minutos a 4°C) se llevaron a cabo

MATERIALES Y MÉTODOS | 35

siguiendo el protocolo descripto en Ledesma y col. (1998). Las tinciones de

superficie se realizaron incubando células vivas con el anticuerpo primario (anti-

PrPC) durante 10 minutos a 12°C y posteriormente fijadas en una solución de

paraformaldehído (PFA) al 4% P/V y sacarosa 4% P/V en PBS durante 15 minutos

a temperatura ambiente. Para la cuantificación de la marcación específica

con el anticuerpo primario se seleccionaron de manera aleatoria distintas áreas

de cada cono de crecimiento o de cada neurita. En el caso de neuronas

maduras las imágenes de contraste de fase se analizaron junto con los ensayos

de marcación con MAP2 y Tau para diferenciar correctamente las áreas

dendríticas de las axonales (Fig. 10). La intensidad expresada en Pixel de la

marcación correspondiente a PrPC en dichas áreas se cuantificó usando el

programa ImageJ de NIH. La intensidad media se calculó por unidad de área.

Los datos se expresaron como la relación entre la media de los valores

provenientes de las neuritas más largas sobre los valores correspondientes a las

neuritas más cortas de un total de 25 neuronas en estadío 3. En el caso de

neuronas maduras (estadío 5) se determinaron los valores medios provenientes

de los axones (procesos MAP2 negativos y Tau positivos) versus los

correspondientes a dendritas (MAP2 positivos y Tau negativos). 70 a 80

dendritas y entre 50 y 60 axones se analizaron para cada condición

experimental. Las áreas de colocalización se calcularon mediante la

superposición (merge) de los mapas de los puntos positivos para cada

marcador. Se consideró como colocalización total (más del 80% de

superposición, determinado por el color amarillo obtenido de la mezcla de la

MATERIALES Y MÉTODOS | 36

señal del canal rojo con la señal del canal verde) o colocalización parcial

(entre 50 - 80% de superposición).

3.4.8 Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y Western blot.

Extractos de neuronas en cultivo se resuspendieron en solución de carga

(Electrophoresis Sample Buffer, 2X (SANTA CRUZ) con azúl de bromofenol, como

indicador de frente de corrida, DTT, TCEP-HCl, SDS, MES, EDTA, Triton X-100 y

glicerol) y se desnaturalizaron durante 5 minutos a 95°C. Las muestras se

cargaron en geles de poliacrilamida al 12% con SDS (SDS-PAGE) y se

procesaron por electroforesis aplicando un campo eléctrico de 100 V a

amperaje constante.

Finalizada la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de

nitrocelulosa (Hybond ECL, Amersham) empleando una cubeta de

transferencia horizontal (Bio-Rad) a la que se aplicó una corriente eléctrica de

100 mA a voltaje constante durante 45 minutos.

La membrana con las proteínas transferidas se bloqueó durante una hora a

42°C con una solución de saturación de BSA 5% en TBS-T (1,36 M NaCl, 26 mM

KCl, 0,25 M Tris y 0,1% Tween-20). Posteriormente se incubó la membrana

durante una noche a 4°C en agitación con el anticuerpo primario diluído en

TBS/0,5% BSA. Después de 3 lavados con TBS-T se incubaron las membranas con

el correspondiente anticuerpo secundario anti-especie conjugado con

peroxidasa (Horseradish peroxidase; HRP) en TBS/0,5% BSA durante 2 horas a

temperatura ambiente con agitación. Tras 3 lavados la actividad de la

MATERIALES Y MÉTODOS | 37

peroxidasa se utilizó para el revelado con el sistema de detección

quimioluminiscente ECL (Western Lightning Plus-ECL, Enhanced

Chemiluminiscence Substrate, Perkin Elmer) y autorradiografía (Amersham

Hyperflim ECL, GE Healthcare). Como control de carga se repitieron los western

blots sobre las mismas membranas con anticuerpos anti a-Tubulina acetilada

después de reacondicionarlas con tampón de extracción (stripping buffer;

compuesto por 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,7 y 2% SDS) incubándolas durante 1 hora

a 42°C.

La cuantificación se llevó a cabo en las autorradiografías escaneadas con

el software de NIH, Image J, en condiciones de señal no saturada.

3.4.9 Ensayos de endocitosis.

Las neuronas en cultivo se incubaron con la subunidad p de la toxina colérica

conjugada con fluoresceína y con el anticuerpo anti-PrPC o TfRc durante 2, 6 y

10 minutos a 37°C. Las células se lavaron con PBS, se fijaron en 4% P/V PFA y 4%

P/V sacarosa durante 15 minutos a temperatura ambiente y se permeabilizaron

con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 5 minutos. Las muestras se bloquearon con

una solución conteniendo 2% suero bovino fetal (FBS), 2% albúmina sérica

bovina (BSA) y 0,2% gelatina en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente.

Tras el bloqueo las células se incubaron con anticuerpos secundarios anti

especie conjugados con rodamina (Alexa) durante 40 minutos a temperatura

ambiente. Se lavaron con PBS y se montaron sobre portaobjetos de cristal

(Línea LAB) utilizando Mowiol y DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane) como

agente anti-apagamiento. Las imágenes se obtuvieron en un microscopio

MATERIALES Y MÉTODOS | 38

confocal (LSM 510 en una plataforma Axiovert 100 M). La colocalización se

determinó mediante la conversión de los círculos coloreados de verde (GM1) y

las agrupaciones en rojo (PrPC y TfRc). El grado de superposición se consideró

como colocalización total (más del 80% de superposición) o colocalización

parcial (entre 50 - 80% de superposición). Se analizaron los cuerpos celulares de

10 neuronas diferentes por condición. Con el objetivo de evaluar el nivel de

endocitosis se contó el número de agrupaciones (clusters) dentro de los

cuerpos celulares, excluyendo aquellas de la periferia que se consideraron

estructuras de la superficie celular. El valor medio del número de clusters en los

cuerpos celulares se normalizó frente al valor medio en neuronas no tratadas y

se expresó como porcentaje de este último.

3.4.10 Ensayos de microscopía electrónica con el uso de anticuerpos.

Secciones ultrafinas de 0,05 jum de espesor provenientes de hipocampos de

embriones de rata embebidas en Lowicryl HM20, se marcaron según el

protocolo descripto por Sassoe-Pognetto & Ottersen (2000). Para ello las

secciones de hipocampo se incubaron con el anticuerpo anti-PrPC diluído en

tampón Tris 5 mM conteniendo 0,3% NaCl y 0,1% Triton X-100 durante 2 horas y

luego con un anticuerpo secundario conjugado con partículas de oro de

10nm.

MATERIALES Y MÉTODOS | 39

3.5 ESTUDIOS REALIZADOS CON NEURONAS HIPOCAMPALES DE RATON.

3.5.1 Aislamiento de membranas libres de lisosomas y de fracciones

enriquecidas en membranas del aparato de Golgi.

Extractos totales de cerebros de ratones se homogeneizaron en tampón

sacarosa-PKM 0,5 M (Fosfato de potasio 100 mM, pH 6,5; MgCh 5 mM, y HCl 3

mM) a 4°C. Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 2500 rpm. El

sobrenadante, libre de núcleos celulares, se centrifugó dos veces más durante

10 minutos a 8000 rpm con el objetivo de obtener una fracción de membranas

libre de lisosomas. Se confirmó que el sobrenadante resultante de estas series

de centrifugaciones a baja velocidad contenía membranas totales sin

lisosomas por western blot, usando anticuerpos específicos contra proteínas

residentes en lisosomas, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, membrana

plasmática y endosomas (Fig. 32A). Para obtener una fracción enriquecida en

membranas de Golgi, se siguió el protocolo indicado por Fath & Burgess (1993)

en el que este último sobrenadante se colocó sobre un gradiente de densidad

discontinuo constituído por sacarosa-PKM 1,3 M y Sacarosa-PKM 0,7 M y se

centrifugó a 17500 rpm en un rotor SW40 durante 60 minutos. Las membranas

que se concentraron en la interfase 0,7/1,3 M se recogieron y llevaron a una

concentración 1,25 M Sacarosa-PKM depositándose en el fondo de un tubo de

ultracentrifugación. Sobre la muestra se cargó primero tampón Sacarosa-PKM

1.1 M y luego otro volúmen del mismo tampón 0,5 M. Se centrifugó a 15000 rpm

en un rotor SW40 durante 90 minutos. Las membranas de Golgi se recogieron en

la interfase 0,5/1,1 M que se ajustó a 0,7 M con tampón Sacarosa-PKM y

MATERIALES Y MÉTODOS | 40

finalmente se centrifugó a 10400 rpm por 15 minutos para concentrarlas en el

precipitado del fondo del tubo.

3.5.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y Western blot.

Extractos de tejido de cerebro o de neuronas en cultivo se resuspendieron en

solución de carga (Electrophoresis Sample Buffer, 2X (SANTA CRUZ) con azúl de

bromofenol, como indicador de frente de corrida, DTT, TCEP-HCl, SDS, MES,

EDTA, Triton X-100 y glicerol) y se desnaturalizaron durante 5 minutos a 95°C. Las

muestras se cargaron en geles de poliacrilamida al 12% con SDS (SDS-PAGE) y

se procesaron por electroforesis aplicando un campo eléctrico de 100 V a